Em 1961, Marshall Nirenberg e James Matthaei foram os autores do primeiro grande avanço na decifração do código genético. Nas suas experiências utilizaram extratos celulares da bactéria Escherichia coli e oligonucleótidos sintéticos, em vez de mRNA natural, como informação padrão para a síntese proteica.

Com o extrato celular de E. coli, preparou-se um sistema de reação completo, com todos os componentes necessários à síntese proteica, incluindo um RNA sintético formado apenas com nucleótidos de uracilo (poli-U). Foram realizados vários ensaios, nos quais se testou individualmente cada um dos 20 aminoácidos. Para tal, o aminoácido testado encontrava-se marcado radioativamente.

Na Tabela 1, está registada a incorporação nas proteínas, em diferentes condições experimentais, do aminoácido fenilalanina marcado radioativamente. Aos ensaios 2 e 4 não foram adicionados, respetivamente, poli-U e ATP. No ensaio 3 foram extraídos os ribossomas. Os ensaios 5 e 6 e os ensaios 7 e 8 continham, respetivamente, os antibióticos puromicina e cloranfenicol e as enzimas hidrolíticas RNAase e DNAase.

Noutras experiências, Nirenberg e Matthaei mostraram que a síntese de um péptido constituído por resíduos do aminoácido lisina estava dependente da adição de poli-A, um RNA formado apenas com nucleótidos de adenina, ao sistema de reação; o mesmo acontecia com a adição de poli-C, um RNA formado apenas com nucleótidos de citosina, que era específico para a síntese de um péptido constituído apenas pelo aminoácido prolina.

Gobind Khorana, agraciado com o Prémio Nobel da Fisiologia ou Medicina em 1968, tal como Marshall Nirenberg, realizou diversas experiências que contribuíram definitivamente para a decifração do código genético. A partir de polímeros de ribonucleótidos, de sequência conhecida, demonstrou que a repetição de dois nucleótidos alternados n vezes, por exemplo (UC)ₙ, contém informação necessária à síntese do péptido (ser-leu)ₙ, em que UCU codificava a incorporação do aminoácido serina e CUC codificava a incorporação do aminoácido leucina.